医用羧甲基壳聚糖 - 羧甲基壳聚糖脱乙酰度和取代度测定

YY/T 0953-2020 医用羧甲基壳聚糖

范围
本标准规定了医用羧甲基壳聚糖原料的要求、试验方法、包装、运输和贮存等。
本标准适用于以壳聚糖或甲 壳素为原料, 经脱乙酰化、羧化、纯化而成的用于制造组织工程医疗器械产品的医用羧甲基壳聚糖。
注: 羧甲基壳聚糖作为其他医疗器械产品的原料使用时可以参考该标准。

术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
壳聚糖  chitosan
由2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖(GlcN)和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖(GlcNAc)通过β(1→4)连接而成的线性聚多糖。其结构式为:


甲壳素  chitin
几丁质
甲壳质
化学名称: β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖，为自然界的一种半透明而坚硬的材料，是真菌的细胞壁和节肢动物的外骨骼里的主要组成部分。
羧甲基甲壳素  carboxymethylchitin
甲壳素的羟基上的氢被羧甲基取代后的产物。
羧甲基壳聚糖  carboxymethylchitosan
羧甲基甲壳素脱乙酰化后或壳聚糖的羟基/氨基上的氢被羧甲基取代后的产物。
残留物  residues
在原料中存在或材料加工过程中引入(或产生)的可能对人体产生一定副作用的需要去除而可能在最终产品中仍然会残留的某种(些)物质。
降解  degradation
环境条件下引起的材料的化学键断裂，导致机械性能和/或化学完整性降低。
体外降解  degradationinvitro
贮存于生理液中或模拟环境中所引 起的降解。

动物源性材料要求
动物源性初始原料，应按 YY/T 0771.1、YY/T 0771.2 和 YY/T 0771.3 的要求进行管理和控制。

技术要求
外观
羧甲基壳聚糖应为白色或淡黄色固体，无肉眼可见异物。
鉴别
羧甲基壳聚糖的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)，在3250cm^-1~3450cm^-1(宽峰)、2910cm^-1~2950cm^-1、1600cm^-1(或1654cm^-1和1550cm^-1)、1380cm^-1(或1410cm^-1和1323cm^-1)有羧甲基壳聚糖特征吸收峰。 除了3250cm^-1~3450cm^-1和2910cm^-1~2950cm^-1波数处的吸收峰外，其他特征吸收峰实测值的波数误差应小于规定值的0.5%。
注: 羧甲基壳聚糖参考红外图谱参见附录A。
取代度(羧化度)
羧甲基壳聚糖的取代度应大于80%。
脱乙酰度
羧甲基壳聚糖的脱乙酰度应符合标示值。
等电点
羧甲基壳聚糖的等电点应符合标示值。
干燥失重
羧甲基壳聚糖的干燥失重应不大于15%(质量分数)。
pH值
羧甲基壳聚糖检验液的pH值应在6.0~8.0之间。
羧甲基壳聚糖如果主要以钠盐形式存在，其检验液的pH值应符合标示值。
透光率
羧甲基壳聚糖检验液在波长660nm处透光率应不小于98.0%。
重均分子质量及分子质量分布
应确定羧甲 基壳聚糖的重均分子质量和允差范围，分子质量分布系数应在1.0~3.0范围内。
紫外吸光度
羧甲基壳聚糖检验液在260nm和280nm波长处的吸光度均不大于0.1。
羧甲基壳聚糖含量
羧甲基壳聚糖含量应不小于85%(质量分数)。
蛋白质含量
羧甲基壳聚糖蛋白质含量应不大于0.2%(质量分数)。
重金属和微量元素
羧甲基壳聚糖重金属总量(以Pb²⁺计，铁元素除外)应不大于10μg/g。
总砷含量不大于4μg/g，汞含量不大于4μg/g，铁含量不大于50μg/g。
炽灼残渣
羧甲基壳聚糖炽灼残渣应符合标示值。
不溶物
羧甲基壳聚糖中不溶物应不大于0.5%(质量分数，以干燥品计)。
残留物
乙醇残留量
羧甲基壳聚糖中乙醇残留量应不大于0.5%(质量分数)。
二甘醇酸残留量
羧甲基壳聚糖中二甘醇酸残留量应不大于0.1%(质量分数)。
其他残留物
若产品含有《中华人民共和国药典(2015年版四部)》0861残留溶剂测定法附表1中一、二类溶剂，以及经确证含有的其他有害残留物，应按 GB/T 16886.17 要求给出许可量。
无菌或微生物限度
若原料标示为“无菌"，应通过无菌检查，或者通过生产者的文件验证是否符合无菌规定。
若原料为非无菌，需氧菌总数应小于100CFU/g，霉菌和酵母菌菌落数应小于10CFU/g，不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌。
细菌内毒素
若原料标示为“无菌"，细菌内毒素应小于0.05EU/mg。
生物学评价
应按照 GB/T 16886.1 的要求进行生物学评价。

试验方法
取代度(羧化度)
按照附录B规定的方法测定，应符合"取代度(羧化度)"规定。
脱乙酰度
按照附录B规定的方法测定，应符合"脱乙酰度"规定。

附录B  (规范性附录)
羧甲基壳聚糖脱乙酰度和取代度测定

原理
取代度为试样中羧甲 基的总摩尔数占试样中总的氨基糖单元摩尔数的百分数，脱乙酰度为试样中脱乙酰基的氨基糖单元摩尔数占试样中总的氨基糖单元摩尔数的百分数。
将试样溶于盐酸溶液，用氢氧化钠标准溶液将已知量的酸式羧甲基壳聚糖重新滴定成钠盐，滴定曲线中先后出现第一拐点(过剩盐酸滴定终点)，第二拐点(羧基滴定终点)，第三拐点(氨基滴定终点)，可测得试样中羧基和氨基的含量，从而计算出羧甲基壳聚糖的取代度和脱乙酰度。

设备与试剂
分析天平，滴定仪(或碱式滴定管、酸度计和恒温磁力搅拌器)，盐酸(分析纯及以上)和氢氧化钠滴定液。

实验步骤
取0.1g羧甲基壳聚糖，精密称定，加入20mL 0.3mol/L盐酸溶液溶解，用0.1mol/L氢氧化钠滴定液滴定，记录滴定液消耗的体积与pH值。 以滴定液消耗的体积为横坐标，溶液的pH值为纵坐标作图，得到所测样品的pH滴定曲线，或者以滴定液消耗的体积为横坐标，ΔpH/ΔV_NaOH为纵坐标作图，得到一阶曲线。
注1: 可根据具体情况调整样品的取样量、盐酸溶液浓度和体积。
注2: 如果在曲线上无法确定突跃点，可通过观察原始滴定数据的变化值并结合pH值范围来确定。

计算
羧甲基壳聚糖取代度和脱乙酰度分别按式(B.1)和式(B.2)计算。

式中:
ω_DS ——样品取代度，%；
ω_DD ——样品脱乙酰度，%；
203 ——N- 乙酰氨基-D-葡萄糖结构单元相对分子量；
ΔV₁ ——第一和第二突跃点之间消耗的NaOH滴定液的体积之差，单位为毫升(mL)；
ΔV₂ ——第三和第二突跃点之间消耗的NaOH滴定液的体积之差，单位为毫升(mL)；
c₁  ——NaOH滴定液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
m  ——样品质量，单位为毫克(mg)；
ω₀ ——样品的干燥失重，%；
80 ——羧甲基钠的相对分子质量；
42 ——乙酰基的相对分子质量。